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정자 형성의 여러 단계를 연구하기 위해 특정 발달을 분리 할 수있는 것이 유용합니다
단계. 그러나, 여러 층의 생식 세포가 정소에 동시에 존재하기 때문에,
특정 배아 세포 집단은 어렵다. 인구 특이적인 세포 표면 마커를 확인할 수 있다면,
이들 집단은 항체 염색 및 FACS (형광 활성화 세포
정렬). 실제로이 접근법은 줄기 세포 풀에서 성공적으로 사용되었습니다 (Oatley and Brinster 2008;
Shinohara 2000). 그러나, 차별화의 후반 단계에서 비교적 적은 특정 마커가 알려져 있으며,
이러한 마커 중 적은 수가 FACS에 적합한 세포 표면 단백질입니다. 대안으로
조사자는 두 가지 종류의 기술을 사용했다 : 세포에 기초한 분리
크기 및 DNA 염색 강도에 따른 분리. 이러한 기술과 함께, 조사자
성인의 고환보다는 사춘기의 고환을 사용하는 경우가 있습니다.
이질.
정렬 방법의 첫 번째 클래스는 셀 크기를 기반으로합니다.
세균 세포 개체군 그라디언트에 침전물. 가장 흔한 기술을 "단위 중력
"고환은 단일 세포 현탁액으로 해리되며,
원심 분리없이 단위 중력에서 2 ~ 4 시간 동안 얕은 구배를가집니다 (Bellve 1993; Bellve 1977).
이러한 조건에서 침전 속도는 주로 밀도보다는 셀 크기에 의해 결정됩니다. 더 큰
세포 침전이 더 빠르다 (Sharpe 1998). 이 기술은 비교적 세균 세포 유형에 대해 잘 작동합니다
고환에 유행하고 독특한 크기를 가지고 있습니다. 따라서, 단위 중력 침강은 고순도의
다음 세포 유형 : 둥근 spermatids, (성인 고환에서 격리); 파키 텐 및 프리 렙토텐
spermatocytes ( "p 17"고환에서 분리, 즉 출생 후 17 일); A 형 및 B 형 spermatogonia
(p8 고환에서 분리됨) (표 1.1). 반대로, 단위 중력 침강은 leptotene에서 제대로 작동하지 않습니다.
및 zygotene spermatocytes가 있습니다. 이들은 크기가 매우 비슷하고 희귀합니다. 그리고 물론, 단위
중력 침강은 A1 / A2 / A3 / A4 spermatogonia와 같은 크기의 세포를 분리 할 수 ??없으며둥근 spermatid 발달의 다른 단계. 또한, 단위 중력 침강은 시간 소모적이다
특수 장비 및 많은 양의 입력 물이 필요합니다. 이러한 제한에도 불구하고
가장 효과적인 기술 중 하나이며 일반적으로 사용됩니다 (Lesch 2013; Namekawa 2006).
분류 방법의 두 번째 부류는 DNA 염색 강도에 근거합니다. 고환은 해리된다.
단일 세포 현탁액에 넣고 Hoechst 33342와 같은 DNA 염색 염료와 함께 배양한다.
Hoechst 33342 형광의 강도에 기초한 FACS로 분리 하였다. 모든 세포 유형에는 자체 세포가 있습니다.
DNA 함량, 염색질 구조 및 능력에 영향을받는 명확한 형광 강도
유출 염료 (Bastos 2005, Getun 2011). 높은 순도를 달성하기 위해 세포는 Hoechst
33342 형광은 세포 크기와 밀도에 따라 달라지는 광산란 특성
(Gaysinskaya 2014). 이러한 DNA 염색 / FACS 방법은 개체군을
다른 DNA 내용; 즉, 감수성 세포에서 spermatogonia (주로 2S)를 분리 할 때
(1S)에서 prophase (4S). DNA 염색 / FACS는
프리 렙토텐 (preleptotene), 렙토텐 (leptotene) 및 렙토텐 (laptotene)의 순도가 높지만 상대적으로 높은 순도의 감수성 하위 집단
zygotene spermatocytes는 여전히 제한되어 있습니다.성인의 고환에서 배아 세포 집단을 분류하는 것은 특히 어렵다.
극단적 인 세포 이질성. 성인 고환은 여러 층의 생식 세포를 포함하고 있으며, 대부분의
이는 일 상체 수태체이다. 분류를 단순화하기 위해 (특히, spermatid의 문제를 우회하기 위해
오염), 수사관은 때때로 성인보다는 사춘기의 고환을 사용합니다. 정자 형성
출생 후 시작; 따라서 신생아 고환은 미분화 된 정자 증식 만 포함하고 점차적으로
더 차별화 된 배아 세포 유형은 추후 시점에 존재한다. 이른바 "첫 번째 물결"
spermatogenesis "는 특정 배아 세포 집단을위한 출발 물질을 풍부하게하는 매우 유용한 도구이다.
"정자 형성의 첫 번째 물결"을 "분류"기술로 자체적으로 사용할 수 있습니까? 에 대한
예를 들어, leptotene spermatocytes를 연구하기 위해, 우리는 모든 사춘기 testis를 수집 할 수있는 시점에서
leptotene spermatocytes가 가장 풍부합니다 (-p8-10)? 이 접근법이 시도되었다 (Margolin 2014;
Shima 2004). 그러나 심각한 한계가있다. 전체 사춘기의 고환 표본은 필연적으로
원하는 배아 세포 유형뿐만 아니라 체세포 및 어린 배아 세포 세대를 포함한다. 더 나쁜 것은, 첫 번째
spermatogenesis의 물결은 동기가 아닙니다 (Snyder 2010). 따라서, 원하는 농축 물
발달 단계는 매우 열악합니다. 예를 들어, p8-10에서도 세뇨관의 13 %만이 leptotene
spermatocytes (Nebel 1961). 이 세관에는 체세포 및 초기의 생식 세포도 포함되어 있기 때문에
이것은 leptotene spermatocytes의 10 % 미만의 전체 순도에 해당합니다.
분명히 정렬에 대한이 세 가지 방법 중 어느 것도 완전히 만족스럽지 않습니다. 단위 중력
침전 및 DNA 염색 / FACS 모두 합리적으로 높은 순도를 제공하지만 특정 세균에만 작용합니다
세포 유형 및 특수 장비 및 기술이 필요합니다. "첫 번째 물결"중 시간 초과 수집
간단하고 장비가 필요하지 않으며 모든 세포 유형에 사용할 수 있지만 순도가 너무 낮아
많이 사용합니다. 고환에서 배아 세포 집단을 분류하기위한 추가적인 기술이 분명한 필요성이 있습니다.